Investigadores de la FCV-UNR desarrollaron un test de detección del virus de Influenza A en cerdos que cuesta 80% menos que los fabricados en el exterior

Se trata de una alternativa de diagnóstico sensible y eficaz que utiliza anticuerpos derivados de la yema de huevo de gallina.

Muestra positiva

En las granjas de producción porcina cuando los cerdos se infectan con virus de Influenza A (VIA) se generan grandes pérdidas económicas debido a la disminución del consumo del alimento y la predisposición a infecciones bacterianas secundarias. Además, en las granjas de nuestro país los VIA tienen un comportamiento endémico con manifestación clínica poco evidente, lo que dificulta su detección. En Argentina, los métodos utilizados más habitualmente para la detección de los VIA en los cerdos incluyen las técnicas de biología molecular y serología, las cuales son complejas, costosas, además de que cuentan con tiempos de procesamiento relativamente prolongados y deben ser realizados en laboratorios específicos, por personal idóneo.

En este marco, IntelVet dialogó con las médicas veterinarias Carina Peirone y Mariana Biscia, quienes encabezan un grupo de trabajo de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de Rosario, que desarrolló una técnica de ensayo de inmunotransferencia de punto o “Dot Blot”. Se trata de una técnica simple que consiste en unir un antígeno o anticuerpo a una membrana de nitrocelulosa o nylon e identificar una proteína conocida en una muestra biológica y representa una alternativa de diagnóstico más económica y accesible.

“La idea fue desarrollar un test rápido, eficaz, que tenga buena sensibilidad y especificidad para trabajar a campo”, expresó Peirone para luego agregar que “la técnica de inmunocromatografía lateral, está disponible en el mercado pero es de producción extranjera lo que hace que sea costoso y haya problemas de importación”, expresó Peirone.

Tira reactiva

Para la elaboración de inmunoensayos, como el Dot Blot e inmunocromatografía, los anticuerpos derivados de la yema de huevo (IgY) constituyen una excelente alternativa a los anticuerpos de mamíferos (IgG). “Trabajo desde hace años en la producción y purificación de estos anticuerpos que son usados tanto en inmunoterapia como en inmunodiagnóstico”, mencionó Peirone.

Al respecto, Biscia añadió que “el hecho de producir anticuerpos en gallinas tiene un fuerte sentido de bienestar animal ya que de este modo, y a diferencia de los obtenidos en mamíferos, no hay necesidad de extraer sangre de los animales empleados para obtener los anticuerpos”.

Para obtener los anticuerpos IgY anti VIA, se inmunizaron tres gallinas ponedoras de raza colorada de 20 semanas de vida. Como inmunógeno se utilizó 1 ml de una suspensión de cultivo celular con varias cepas regionales del VIA obtenidas de cerdos, emulsionado con adyuvante incompleto de Freund, en partes iguales.

Sobre este punto, Biscia valoró que “la posibilidad de usar cepas de virus de influenza nacionales, aisladas de cerdos infectados naturalmente, aumenta la sensibilidad y la eficacia de los kits ya que, en algunos casos, los test pueden generar falsos negativos cuando la cepa que está circulando entre los animales infectados y la que se utiliza para desarrollar el kit son antigénicamente diferentes”.

Por otro lado, Peirone se refirió a los inconvenientes que tuvieron que atravesar en el proceso de desarrollo del test: “el primer problema fue poder adquirir los insumos y sus costos. Para solucionarlo investigamos y buscamos la forma de reemplazar algunos reactivos. Otro problema fue que en la muestra había muchas proteínas contaminantes que, al trabajar con un anticuerpo policlonal, se unían de forma inespecífica, disminuyendo la sensibilidad y la especificidad del test. Entonces comenzamos a tratar de dilucidar cuáles era los problemas y modificamos la técnica y actualmente estamos avanzando en cambios para poder hacerla más específica”.

Muestra negativa

Un test extranjero actualmente se puede adquirir a un precio de entre $2000 y $2500, aproximadamente, mientras que el test desarrollado por las investigadoras de la FCV-UNR cuesta entre $300 y 400$. De todos modos, las veterinarias concuerdan en que “la mayor ventaja es que se puede realizar la prueba a campo y en 10 o 15 minutos se obtiene el resultado sin necesitar ni aparatos complejos ni personal altamente capacitado para realizarlo e interpretar los resultados”.

“La posibilidad de desarrollarlo en el país es excelente para que esté al alcance de todo el mundo a un bajo costo. También se puede desarrollar para cualquier tipo de patología animal y los anticuerpos se pueden utilizar para realizar inmunoterapia”, valoró Peirone.

DESARROLLO Y COMERCIALIZACIÓN

Al consultar sobre un próximo paso de comercialización del producto, Peirone expresó que “con intervención del Estado se puede desarrollar el producto de forma comercial pero también se necesita un laboratorio elaborador, con todas las instalaciones y habilitaciones correspondientes, para llevarlo adelante”.

Para llegar a ese punto es necesario “incentivar a los médicos veterinarios a utilizar esta técnica económica para generar la demanda y que algún laboratorio se anime a desarrollar y comercializar el producto”, complementó Biscia.

MÉTODO DE OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS

Las aplicaciones se realizaron vía intramuscular en la pechuga, cada 15 días, cuatro veces. Los huevos se juntaron a partir de los 30 días de la primera inoculación. Los anticuerpos IgY se purificaron de la yema de huevo por deslipidación seguida de precipitación. Se utilizaron dos membranas de nitrocelulosa de 12 μm de tamaño de poro, una para el control positivo y otra para el control negativo donde se colocaron 5 μl de una solución de anticuerpos con IgY anti VIA diluída al 50% con PBS y se dejó secar 2 horas en estufa a 37oC.

La solución de anticuerpos empleada tenía una concentración inicial de 18 mg/ml. Una vez secas, las membranas se colocaron en una solución de bloqueo de uniones inespecíficas (3% de leche descremada y 0.05% de Twin 20, en PBS) durante toda una noche, a 4oC. Se enjuagaron 3 veces con una solución de lavado (0.05% de Twin 20, en PBS) y se secaron en estufa a 37oC, durante 1 hora. Para evaluar la capacidad de detección de VIA, una parte de las membranas se incubaron con el antígeno (inmunógeno utilizado para la obtención de IgY anti-VIA), utilizado como control positivo. Con la otra membrana se empleó PBS como control negativo.

En ambos casos, la incubación fue a temperatura ambiente durante 1 hora. Las membranas se enjuagaron y secaron en estufa a 37oC, durante 2 horas. Una vez secas, se sumergieron en una solución de anticuerpo IgY anti VIA conjugado con remazol violeta brillante 5R a temperatura ambiente durante 1 hora, se enjuagaron y se dejaron secar a temperatura ambiente.

Finalmente, se realizó la observación de la formación o no de un círculo de coloración violeta sobre las membranas. Como resultado de los ensayos, en el caso de las membranas incubadas con el control positivo, se observó la formación de un anillo de color violeta, indicando la detección de los controles positivos.

Por su parte, en el control negativo, no se observaron uniones inespecíficas ni ruido de fondo (background) (Foto 2). En base a la observación en las membranas con controles positivos, de un anillo violeta, la sensibilidad obtenida puede considerarse baja, ya que la reacción colorimétrica sólo se observó en los márgenes (donde se produce una mayor concentración de anticuerpos) y no en todo el círculo. Los datos obtenidos de ambas membranas no fueron suficientes como para analizarlos estadísticamente.

EQUIPO DE INVESTIGADORES

El desarrollo del proyecto estuvo financiado por la Universidad Nacional de Rosario, a través del Programa de Acreditación de Proyectos de Investigación. De la investigación también formaron parte Meroi, Lucio Andrés; Girotti, Aldana del Luján; Galiñanes, Antonella Esther; Anthony, Lilian María y Sarradell, Javier Eduardo.

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